PCR 扩增后的产物往往要克隆到载体中，传统的克隆方法主要有限制性酶切与连接法和 TA 克隆法。由于在 PCR 片段的两端酶没有足够的空间和其结合，因此 PCR 片段的酶切比质粒酶切要困难的多。为了把 PCR 片段克隆到其他的另外的载体中，第一步是把 PCR 片段克隆到 T vector 或 pUC18 这样的 PCR 克隆载体中。但是 TA 克隆的缺点也很明显，诸如需要单独购买 T 载体，连接效率不高，需要进行亚克隆等。

如何把 PCR 片段直接克隆到一个克隆载体中？

有时需要把 PCR 片段直接克隆到一个克隆载体中。PCR 片段和载体使用同样的酶进

行酶切。把经过酶切的 PCR 片段和经过酶切的载体连接起来。

要使这种酶切和连接的成功率更高，以下几点非常重要：

– 设计引物时需要加保护碱基。

– PCR 片段酶切需要的时间可能比质粒酶切时间长。

– 如果直接克隆很困难，可以先 PCR 片段克隆到 T vector 或 pUC18 这样的 PCR克隆载体中，然后再克隆到另外的载体。

– 为了节省时间，明智的选择是克隆到 T vector 或 pUC18 这样的 PCR 克隆载体和克隆到另外的载体同时进行。

– 片段与载体的量要足够.

如何更换载体？

在做克隆之前，作酶切位点的分析很重要：

– 用于克隆的酶在目的载体和基因片段都必须是唯一的。

– 请检查要使用的酶切位点在目的载体的位置。如果两个酶切位点挨的很近，先进行一个酶切，再进行另一个酶切很必要。也就是说，先用第一个酶切质粒，进行完胶回收后再进行第二个酶切。

– 酶切要使用足够量的质粒：有足够的质粒用于酶切和胶回收很重要。一个克隆培养 15mL 培养基，小量抽提质粒可以获得足够质粒。

– 如果使用的酶对于目的质粒没有切开，可以用这个酶切一下 pUC18 以便检查这个酶是否好用。如果这个酶能酶切 pUC18 而不能酶切你的目的质粒，解决办法是重新制备你的目的质粒。如果这个酶不能酶切 puc18，解决办法是从另外的公司重新定购这个酶。

如何观察阳性克隆？

在作克隆时，同时作一个阴性对照很重要。例如作连接时，载体自连作一个，插入片段自连作一个。

理想的情况应该是这样的：

– 如果在阴性对照的平板上长 10-20 个克隆。而在你连入片段的平板上长超过40 个克隆。在这种情况下，挑选一些克隆作检测，就可以挑选出阳性克隆了。

– 如果在阴性对照的平板上没有长克隆，就有些麻烦了，有可能酶切时间过长，导致酶切和连接失败。

酶切克隆：

尽量使用相同公司的酶，先低盐后高盐，Buffer 控制在活力 50%以上，尽量考虑通用Buffer。

所有的限制性内切酶切割 DNA 均产生含 5′磷酸基和 3′羟基基团的末端。有些酶能使其识别序列相对两链之间的数个碱基对(base pairs)分开，形成 5′末端突出的粘性末端。还有一些酶产生具有 3′末端突出的粘性末端。如图所示

EcoRI5′-G▼AATT C-3′      MunI5’-C▼AATTG-3’

3′-C TTAA▲G-5′        3’-GTTAA▼C-5’

而另有一些酶切割 DNA 后产生平头或钝性末端(blunt end)，如HpaI: 5′- GTT▼AAC -3′     SmaI: 5′- CCC▲GGG -3′EcoRV: 5′- GAT▲ATC -3′

3′- CAA▲TTG -5′3’     - GGG▲CCC-5’       3’- CTA▲TAG-5’

有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割 DNA 后产生相同类型的粘性末端，称配伍末端(compatible end），可进行相互连接；产生平端的酶切割 DNA 后，也可彼此连接。

TA 克隆

原理：应用了 taq DNA polymerase 的扩增特性，在扩增后的片段尾部自动加一个 A，根据碱基配对原则，人为设计出末端含有 T 的载体，AT 配对，在 T4 DNA ligase 的作用下，把片段和载体连接在一起。PCR 片段克隆到 T vector 克隆载体：T vector 在载体的两端各有一个突出的 T。如果扩增 PCR 片段使用的是 Taq 酶，那么扩增出的 PCR 片段在其两端都有一个突出的 A。这样 T vector 和 PCR 片段的 TA 碱基配对就很容易克隆。

每个人掌握 PCR 片段克隆到 T vector 克隆载体这个技术是很重要的。但是请记住如果扩增 PCR 片段使用的是 pfu 等具有外切酶活性的酶，克隆到 T vector 不适用。

平末端克隆

首先将载体线性化，然后 CIAP 去磷酸化处理。 连入片段。克隆方向和载体自连问题比较突出。